1858年(安政5年)夏秋之间，日本政坛的上空乌云密布，电闪雷鸣。幕府、朝廷、雄藩之间的较量在升级，矛盾尖锐、达到白热化。6月4日，谱代大名、彦根藩藩主井伊直弼出任大老，以迅雷不及掩耳之势迅速处理日美条约和将军继嗣等政治悬案。
到了7月29日，井伊直弼不顾孝明天皇的反对，与美国订立《日美友好通商条约》，公然以“违敕”的不妥协姿态，向朝廷和一桥派雄藩大名挑战，于8月4日召集诸大名入将军居城，当众宣布确定纪伊藩藩主德川家茂为继任将军。
井伊的专横引起许多大名的不满，追随大名的武士们更是群情激愤。井伊态度强硬，8月13日下令处分一桥派大名，命尾张藩藩主德川庆胜和越前藩藩主松平庆永闭上嘴巴、关门反省，责令德川齐昭闭户不出，禁止水户藩藩主德川庆笃和一桥庆喜等入将军居城议政，试图将这些与自己意见相左的大名们逐出政坛，重建幕府一言堂的独裁体制。
对那些游说公卿、策动天皇降旨并严词责备幕府缔结条约和处分一桥派大名的志士，如梁川星岩、梅田云滨、西乡隆盛等，则严惩不息。10月13日下令在京都逮捕梅田云滨，接着组成由大目付、目付以寺社、町、勘定三奉行为主的侦察、审判机构“五手挂”，在京都、江户举行大搜捕，开始了血腥。持续到1859年11月，史称“安政大狱”。
在“安政大狱”中，吉田松阴、桥本左内、赖三树三郎、水户藩武士茅根伊予之介、鹈饲吉左卫门、幕臣家臣饭泉喜内等被斩首；水户藩家老安岛带刀被迫切腹自杀。梅田云滨、萨摩藩武士日下部伊三次等囚死狱中，一桥庆喜、德川庆胜、松平庆永被监押。土佐藩藩主山内丰信被软禁；萨摩藩的西乡隆盛、僧侣月照被追捕投海自杀，西乡幸而获救。青莲院宫尊融亲王、内大臣一条忠香被软禁。长达1年有余的“安政大狱”，涉嫌株连者百余人，血雨腥风遍及日本各地。
井伊的铁血，迫使中下级武士和草莽志士们放弃坐而论道的“处士横议”，转而抡起日本刀，以暴力对抗暴力。在尊王攘夷的口号下，开始了伴随着刀光剑影的武力抗暴行动。大老井伊直弼成为志士们刺杀的第一个目标。在“安政大狱”中受迫害最重的水户藩武士，则成为初期尊王攘夷的急先锋和袭击幕府的突击队。
1860年1月8日，幕府勒令水户藩交出天皇1年半以前下达的诏敕，在藩内引起强烈反响。郡奉行野村彝之助、金子孙二郎和水户藩吏“奥右笔头取”高桥多一郎、“郡方勤”关铁之介等激烈反对交出诏敕，要求赦免德川齐昭、庆笃，得到藩内众多神官、乡士的有力支持，愈加气势汹汹。
然而，朝廷在井伊等压力下，降旨水户藩。同年1月12日藩厅采纳主张妥协的会泽安的意见，决定交出诏敕。消息传开，野村等怒不可遏，在策划以实力阻止上交诏敕的同时，加紧密谋刺杀井伊的计划。
3月23日，野村召集20余名志士在日本桥和品川的料理亭中聚会，杯觥交错之间商定了行动方式、分工负责。决定实行刺杀井伊的日期为当年的上巳节，由关铁之介现场指挥，参加行动的人员由萨摩藩武士有村治左卫门和关铁以下17名水户藩武士组成。野村、金子、高桥等前往京都、大阪或西南诸藩联络各地志士，为向天下申明行动的意义，起草声讨井伊的檄文《斩奸趣意书》。
1860年3月24日是旧历3月3日。按照旧例，将军府在这个节日的当天，应当欢宴幕府高官大吏。大老井伊直弼职位在群吏之上，自然是出席宴会最尊贵的客人。
当天清晨，井伊在60余名武士的护卫下，乘轿向江户将军居城进发。几乎在同时，关铁以下18名志士下定必死的决心，集合在江户芝的爱宕山，相互叮嘱一番后，便三五成群地分头走向井伊登城的必经之处一樱田门。
作为彼此识别的标志，志士们手持大名、旗本的人名录《武鉴》，扮装成观看大名登城行列的乡下武士，先后抵达樱田门外，等待着性命交关的搏击时刻的到来。
上午9时许，井伊一行出现在樱田门外。这时，走在最前列的卫士发现有人手持状纸，逼近过来，似乎要拦轿喊冤，直诉苦情。正待喝止，只见那人冷不防拔出利刀，直劈过来，卫士猝不及防，被当场杀死。前卫队正混乱间，突然一声枪响，震耳欲聋。
轿中的井伊被击中，动弹不得。卫士们来不及甩掉雨披、抽出刀剑，就被四面八方冲上前来的志士们包围，只得边退离轿子，边抽刀迎战。混战中，发狂的志士们集中攻击井伊的乘轿，一面愤怒地咒骂，一边用利刀乱刺轿中的井伊。
萨摩志士在村治左卫门怒吼一声，将奄奄待毙的井伊从轿中拖出，狠狠地割下其首级。一场恶斗过去，樱田门外洁白的雪地上，脚印狼藉，溅满鲜血，井伊大老横尸街头。彦根藩卫士8人被杀，10余人负伤。参加刺杀行动的18名志士1人战死，4人重伤自杀，8人在撤离现场后分别至龙野、熊本藩邸自首，5人逃出。
前往龙野藩邸自首的志士斋藤监物交出《斩奸趣意书》,公开了刺杀大老井伊的动机，即讨伐这位“天下巨贼”井伊直弼，是因为他违敕签约、迫害亲王公卿、屠杀草莽志士，必须替天行道，对其加以“天诛。刺杀井伊是为声讨其不忠与卖国行为，是为国除奸的仗义之举。
刺杀井伊的行动并非否定幕府统治本身，而是排除尊王攘夷的障碍、针对井伊个人的“清君侧”式的行动。
然而，在光天化日、众目睽睽之下，身居高位、手握重权的大老被当众刺杀，登城的旗本闻讯后四散逃跑，围观的江户市民汇集如山、拍手称快等情况，从不同侧面反映了幕府威信扫地、丧失人心，迫使幕府不得不改变攘夷派的政策。
井伊直弼死后，盘城平藩藩主、若年寄安藤信正出任首席老中，关宿藩藩主、寺社奉行久世广周出任老中，形成安藤一久世体制。在这一体制下，幕府对外开国的方针不变。继续邀请欧洲各国访问日本，并与他们签订开放港口的条约。此举在尊王攘夷的志士们眼中，无疑是变本加厉的卖国行为。
对内，幕府抛弃井伊直弼的强行方针，竭力修补幕府与朝廷、雄藩的关系。但是，对于渴望改革的和救国的尊王攘夷派看来，幕府的行为并没有多大改变，他们仅仅在维护少数统治者的利益和地位，对下层武士和普通民众的死活仍然漠不关心。
这些改革者们在刺杀井伊直弼后，终于看清了德川家的真正嘴脸，决定不再奉行“尊王攘夷”的策略，而是推翻幕府和这些为幕府卖命的地方大名们。为日本带来真正的变革。
尊王攘夷运动在此之后变为了倒幕维新运动，他们将目光投向了当时仅有十四岁的明治天皇，一场更大的风暴正在江户和京都之间的土地上酝酿开来。
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